Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad-spectrum coronavirus protease inhibitor

 Coronavirus

  एक व्यापक स्पेक्ट्रम  Coronavirus कोरोनावायरस प्रोटीज अवरोधक द्वारा बिल्लियों में घातक कोरोनावायरस संक्रमण की प्रगति का उलटा

कोरोनावीरस सार

कोरोनावीरस  Coronavirus जानवरों और मनुष्यों को संक्रमित करता है जिससे कई प्रकार की बीमारियाँ होती हैं। कई स्तनधारी प्रजातियों में कोरोनाविरस की विविधता प्रतिकृति के दौरान अपेक्षाकृत उच्च उत्परिवर्तन और पुनर्संयोजन दर द्वारा योगदान की जाती है।  Coronavirus कोरोनाविरस की यह गतिशील प्रकृति एक मेजबान में ऊतक या सेल ट्रॉपिज़्म में क्रॉस-प्रजाति के संचरण और पारियों की सुविधा प्रदान कर सकती है, जिससे वायरलेंस में पर्याप्त परिवर्तन होता है। बिल्ली के समान आंत्रशोथ (FECV) बिल्लियों में अनुचित या हल्के आंत्रशोथ का कारण बनता है, लेकिन एक अत्यधिक घातक बीमारी, जिसे फ़लाइन संक्रामक पेरिटोनिटिस (FIP) कहा जाता है, FECV से FIP  Coronavirus वायरस (FIPV) के उत्परिवर्तन के माध्यम से उत्पन्न हो सकता है। एफआईपी का रोगजनन प्रतिरक्षात्मक प्रतिक्रियाओं से जुड़ा हुआ है और इसमें टी कोशिकाओं का क्षय होता है, जो कुछ अन्य  Coronavirus कोरोनवीरस जैसे गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस द्वारा साझा की गई विशेषताएं हैं। मनुष्यों या जानवरों में अत्यधिक  Coronavirus वायरल  Coronavirus संक्रमण के बढ़ते जोखिम प्रभावी एंटीवायरल दवाओं के लिए कहते हैं, लेकिन अभी तक ऐसा कोई उपाय उपलब्ध नहीं है। पहले, हमने उन अवरोधकों की रिपोर्ट की है जो महत्वपूर्ण मानव और पशु कोरोनवीर के खिलाफ व्यापक स्पेक्ट्रम गतिविधि के साथ 3 सी जैसे प्रोटीज (3CLpro) को लक्षित करते हैं। यहां, हमने FIP के साथ प्रयोगशाला बिल्लियों में हमारे 3CLpro अवरोधक की चिकित्सीय प्रभावकारिता का मूल्यांकन किया। प्रायोगिक FIP 100% घातक है जब कुछ नैदानिक ​​और प्रयोगशाला संकेत स्पष्ट हो जाते हैं। हमने पाया कि एंटीवायरल उपचार से बिल्लियों की पूरी वसूली हो गई जब उपचार बीमारी के एक चरण में शुरू किया गया था जो कि अनुपचारित होने पर अन्यथा घातक होगा। एंटीवायरल उपचार बुखार, जलोदर, लिम्फोपेनिया में तेजी से सुधार के साथ जुड़ा हुआ था और बीमारी और बिल्लियों के सकल लक्षण 20 दिनों के भीतर या कम उपचार के बाद सामान्य स्वास्थ्य में लौट आए। वायरल टाइटर्स में महत्वपूर्ण कमी बिल्लियों में भी देखी गई थी। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि एफआईपी की प्रतिरक्षा-मध्यस्थता सूजन बीमारी की प्रगति के लिए निरंतर वायरस प्रतिकृति की आवश्यकता होती है। ये निष्कर्ष जानवरों और मनुष्यों में महत्वपूर्ण कोरोनाविरस के विकास के लिए चिकित्सीय रणनीतियों और एंटीवायरल यौगिकों के चयन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं।

कोरोनवीरस Coronavirus मानव : लेखक का सारांश

कोरोनवीरस  Coronavirus मानव और जानवरों में महत्वपूर्ण रोगजनक हैं। यद्यपि कुछ कोरोनविर्यूज़ मनुष्यों और जानवरों में गंभीर घातक बीमारी का कारण बन सकते हैं, Coronavirus संक्रमण के लिए कोई एंटीवायरल दवाएं उपलब्ध नहीं हैं। फेलाइन संक्रामक पेरिटोनिटिस (एफआईपी), वायरल फेलिन कोरोनावायरस के कारण होता है, जो युवा बिल्लियों में मृत्यु का प्रमुख संक्रामक कारण है, और इससे लुप्तप्राय बंदी जंगली बिल्लियों का भी खतरा है। हमने पहले महत्वपूर्ण मानव और पशु कोरोनविर्यूज़ के खिलाफ व्यापक स्पेक्ट्रम गतिविधि वाले छोटे अणु प्रोटीज अवरोधकों की श्रृंखला की सूचना दी है। इस रिपोर्ट में, हम पहली बार, प्रयोगात्मक रूप से प्रेरित एफआईपी के साथ प्रयोगशाला बिल्लियों में प्रोटीज अवरोधकों में से एक की प्रभावकारिता और सुरक्षा के प्रयोगात्मक सबूत प्रदान करते हैं। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि प्रोटीज इनहिबिटर द्वारा वायरस प्रतिकृति के प्रत्यक्ष निषेध को कोरोनावायरस संक्रमण के लिए एक व्यवहार्य उपचार विकल्प के रूप में तैयार किया जा सकता है और हमारे प्रोटीज अवरोधक को एफआईपी के लिए एक प्रभावी चिकित्सीय एजेंट के रूप में विकसित करने की क्षमता है। 

Citation: Kim Y, Liu H, Galacity Kankanamalage AC, Veerasekara S, Hua DH, Groutus WC, et al. (2016) Reversal of the progression of fatal coronavirus infection in cats by a broad-spectrum coronavirus protease inhibitor. PLSS Pathog 12 (3): e1005531 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005531

Editor: Stanley Pearlman, University of Iowa, United States

Received: January 5, 2016; Accepted: March 7, 2016; Published: March 30, 2016

Copyright: © 2014 Kim et al. It is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which allows unrestricted use, distribution and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.

Data Availability: All relevant data are within the paper and its supporting information files.

Funding: In vitro assays and drug synthesis were supported by NIH grant R01AI109039 (http://www.nih.gov, PI: KC) and Morris Animal Foundation M13-006 (http://www.morrisanimalfoundation.org), PI. Yk). PK and Safety Studies was supported by the Winn Feline Foundation Miller Fund MT13-006 (http://www.winnfelineoundoundation.org. PI: NCP). In vivo efficacy studies were supported by the Kansas State University Global Food Systems Program (GPRE002839) (PI: YK). The publication of this article was funded in part by the Kansas State University Open Access Publishing Fund. Funerals had no role in study design, data collection and analysis, decisions for publication, or manuscript preparation.

Competitive interests: I have read the magazine's policy and the authors of this manuscript have the following competing interests: YK, KOC, DHH and WCG have patent claims on protease inhibitors in the manuscript.

परिचय

 Coronavirus में आरएनए वायरस का एक बड़ा परिवार शामिल है जो स्तनधारी और एवियन होस्ट की एक विस्तृत विविधता को संक्रमित करता है जिससे बीमारियों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम होता है।  Coronavirus कोरोनावीरस में एक-फंसे हुए, सकारात्मक-समझ वाले आरएनए जीनोम होते हैं और इन्हें अल्फा-, बीटा-, गामा- और डेल्टाकोरोनवायरस [1] के चार जेनेरा में वर्गीकृत किया जाता है। कोरोनैवीरस प्रतिकृति के दौरान उत्परिवर्तन और पुनर्संयोजन के लिए प्रवण होते हैं और इस प्रवृत्ति ने कोरोनाविरस की मौजूदा विविधता में योगदान दिया है [2, 3]। जानवरों के मेजबानों से संक्रमित नए  Coronavirus कोरोनवीरस के अचानक उभरने, गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनवायरस (SARS-CoV) और, हाल ही में, मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम  Coronavirus कोरोनोवायरस (MERS-CoV), ने मनुष्यों में अत्यधिक वायरल कोरोनावायरस संक्रमण के संभावित जोखिमों के बारे में जागरूकता बढ़ा दी है। मनुष्यों और जानवरों के बीच निकट संपर्क बढ़ाने के साथ कोरोनविर्यूज़ को परेशान करना। हालांकि, कोरोनावायरस संक्रमण के लिए प्रभावी चिकित्सीय उपाय एंटी-कोरोनावायरस एजेंटों [4–8] के विकास में व्यापक प्रयासों के बावजूद अब तक मायावी हैं। टिशू या सेल ट्रॉपिज़्म में बदलाव और इसके परिणामस्वरूप कोरोनवायरस के लिए वायरलेंस में परिवर्तन की सूचना दी गई है; पोर्सिन श्वसन कोरोनोवायरस सूअरों में हल्के श्वसन संक्रमण का कारण बनता है और संभवतः संक्रामक गैस्ट्रोएंटेराइटिस वायरस (टीजीईवी) से उत्पन्न होता है, जो एक उच्च मृत्यु के साथ युवा सूअरों में गैस्ट्रोएंटेराइटिस का एटियलजि एजेंट है, जो अपने जीनोम [9] में सहज उत्परिवर्तन और / या विलोपन के द्वारा होता है। सीमांत रूप से कोरोनोवायरस संक्रमण को इसके ट्रॉपिज्म को बदलकर घातक रूप से बदल दिया जा सकता है, जो कि एफलाइन एंटरिक कोरोनैवायरस (एफईसीवी) के उत्परिवर्तन द्वारा संक्रमित है, जो संक्रामक पेरिटोनिटिस वायरस (एफआईपीवी) [10, 11] को प्रभावित करता है। एफलाइन संक्रामक पेरिटोनिटिस (एफआईपी) ने 1960 के दशक में अपने पहले वर्णन के बाद से आधी सदी के लिए शोधकर्ताओं को साज़िश की है [10]। FECV के साथ संक्रमण जो अनुचित या हल्के आंत्रशोथ का कारण बनता है, बिल्लियों में व्यापक रूप से फैलता है, खासकर उच्च घनत्व वाले वातावरण में, और इसका नैदानिक ​​परिणाम बहुत कम है। हालांकि, बिल्लियों का एक छोटा सा हिस्सा एफआईपीवी संक्रमण के दौरान एफआईपी विकसित करता है और बीमारी का शिकार होता है। प्रकाशित अध्ययन का समर्थन है कि मैक्रोफेज [12-16] के लिए ट्रोपिज्म हासिल करने के लिए वायरस के उत्परिवर्तन के माध्यम से एफआईपी व्यक्तिगत बिल्लियों में उत्पन्न होता है और संक्रमित बिल्लियों की प्रतिरक्षा प्रणाली एफआईपी [11] के रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। FIP दो प्रमुख रूपों में होता है, effusive (गीला) रूप या नॉन-effusive (सूखा) रूप। गीला रूप अधिक सामान्य है (एफआईपी मामलों का 60-70%) और पेट और / या, कुछ हद तक, छाती गुहाओं में तरल पदार्थ के संचय द्वारा विशेषता है [11]। ग्रैनुलोमैटस वास्कुलिटिस अक्सर ओमेंटम, मेसेन्टेरिक लिम्फ नोड्स, और बड़ी आंत की सरोसल सतह में पाया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप विशेषता गीला एफआईपी [11] में शरीर के गुहाओं में प्रोटीन और भड़काऊ कोशिकाओं से समृद्ध होती है। एक्सयूडेट कोशिकाओं के बहुमत वायरस से संक्रमित मैक्रोफेज हैं और इन कोशिकाओं में उच्च वायरस भार का पता लगाया जाता है [17]। वायरस और अन्य भड़काऊ कोशिकाओं से लदे मैक्रोफेज से बने कई ग्रैनुलोमैटस घाव आमतौर पर एफआईपी [17] के दोनों रूपों में ओमेंटम, मेसेन्टेरिक लिम्फ नोड्स, प्लीहा और यकृत जैसे विभिन्न ऊतकों और अंगों में बनते हैं। एफआईपी के नैदानिक ​​लक्षण इसमें शामिल अंगों को दर्शाते हैं और इसमें बुखार, पीलिया, शारीरिक संवेग और वजन घटाने शामिल हैं और यह केंद्रीय तंत्रिका तंत्र और आंखों को भी प्रभावित कर सकता है [11]।

एफआईपी युक्त बिल्लियों में वायरस-प्रेरित इम्युनोपैथोजेनेसिस और लिम्फोपेनिया ऐसी विशेषताएं हैं जो अक्सर मनुष्यों में अन्य कोरोनोवायरस संक्रमणों से जुड़ी होती हैं, जैसे कि एसएआरएस और एमईआरएस। इन कोरोनोवायरस संक्रमणों में देखे गए लिम्फोपेनिया के कारणों को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है, लेकिन प्रकाशित रिपोर्टों का समर्थन है कि लिम्फोपेनिया वायरस के संक्रमण के अप्रत्यक्ष प्रभावों से संबंधित है [18-20]। असंक्रमित टी-कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर एपोप्टोसिस से जुड़े लिम्फोपेनिया प्रायोगिक और प्राकृतिक एफआईपी [11, 17, 21, 22] दोनों की एक प्रमुख विशेषता है और वायरस से संक्रमित मैक्रोफेज और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं [17, 19] द्वारा स्रावित साइटोकिन्स के साथ फंसाया जाता है। लिम्फोपेनिया नैदानिक ​​संकेतों की शुरुआत से पहले और प्रयोगात्मक एफआईपी में रोग की प्रगति और मृत्यु के साथ जुड़ा हुआ है, जो इंगित करता है कि लिम्फोसाइट कमी से जुड़े बिगड़ा सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं एफआईपी रोगजनन [17, 22] में महत्वपूर्ण हैं। एक बार जब बिल्लियों क्लासिक नैदानिक ​​संकेत विकसित करती हैं, तो एफआईपी के लिए घातकता लगभग 100% होती है [17, 23-25] और निदान के समय से मृत्यु या इच्छामृत्यु तक का औसत समय 8–9 दिन [23, 24] होता है। एफआईपी 2 साल से कम उम्र के युवा बिल्लियों के बीच मृत्यु का एक प्रमुख कारण है और दुनिया भर में 100 से 300 बिल्लियों में 1 को मारने का अनुमान है [10, 26]। FIP चिड़ियाघर में लुप्तप्राय विदेशी बिल्लियों को प्रभावित करता है, जैसे जगुआर और चीता [27]। हालांकि, टीके अप्रभावी साबित हुए हैं और उपचार केवल उपशामक है [25]।

एंटी-कोरोनावायरस दवाओं के अध्ययन ने मुख्य रूप से एंटी-एसएआरएस-सीओवी एजेंटों की खोज पर ध्यान केंद्रित किया है। इम्यूनोपैथोलॉजिकल घटक, जैसे SARS, MERS और FIP के साथ कोरोनोवायरस संक्रमणों के लिए प्रभावी उपचार हस्तक्षेप, सुरक्षात्मक मेजबान प्रतिरक्षा को बढ़ाने और रोग प्रतिरोधक प्रतिक्रियाओं को कम करने और एंटीवायरल ड्रग्स को सीधे वायरल प्रतिकृति को बाधित करने के लिए इम्यूनोमॉड्यूलेटरी एजेंटों के विवेकपूर्ण उपयोग को शामिल करने के लिए अनुमानित है। हमने पहले छोटे सिंथेटिक पेप्टिडिल यौगिकों की कई श्रृंखलाओं की रिपोर्ट की है जो एक वायरल-एन्कोडेड प्रोटीज़, 3 सी-जैसे प्रोटीज़ (3CLpro) [28-30] को लक्षित करते हैं। कोरोनोवायरस 3CLpro और पपैन जैसे प्रोटीज (PLP) कार्यात्मक व्यक्तिगत प्रोटीन में वायरल पॉलीप्रोटीन को संसाधित करते हैं और कोरोनवीरस के बीच उनकी संरचना अत्यधिक संरक्षित होती है। चूंकि वायरल प्रोटीज वायरस की प्रतिकृति के लिए अपरिहार्य हैं, कई सिंथेटिक छोटे अणु या प्राकृतिक यौगिक जो 3CLpro या PLP के कोरोनैविरस को लक्षित करते हैं, इन विट्रो सिस्टम [4–8] का उपयोग करके जांच की गई है। हालांकि, प्रायोगिक जानवरों [30, 31] में प्रोटीज इनहिबिटर्स की विवो प्रभावकारिता में केवल कुछ अध्ययनों ने परीक्षण किया। [31] में डेंग एट ने बताया कि पीएलपी अवरोधक फेफड़े में वायरस के टाइटर्स को कम करने या माउस-अनुकूल एसएआरएस-सीओवी से संक्रमित चूहों के अस्तित्व को बढ़ाने में विफल रहा, संभवतः कम जैवउपलब्धता या अवरोधक की स्थिरता के कारण। हाल ही में, हमने दिखाया कि हमारे 3CLpro अवरोधकों ने murine हेपेटाइटिस वायरस (MHV), एक murine कोरोनावायरस [30] से संक्रमित चूहों के जिगर में वायरस के टिटर्स और पैथोलॉजी को काफी कम कर दिया है। उन अध्ययनों में, स्पर्शोन्मुख चूहों में वायरस के संक्रमण के कुछ समय पहले या बाद में उपचार शुरू किया गया था।

यहाँ हमने कोरोनोवायरस 3CLpro अवरोधकों पर अपने पिछले काम को बढ़ाया और फार्माकोकाइनेटिक्स (पीके) की जांच की, बिल्लियों में 3CLpro अवरोध करनेवाला की सुरक्षा और प्रभावकारिता। GC376 एक 3CLpro अवरोधक है, जिसे पहले SARS-CoV [28] सहित कई कोरोनविर्यूज़ के 3CLpro के खिलाफ सक्रिय होने की सूचना दी जाती है, लेकिन सेल संस्कृति में FIPV के खिलाफ उच्चतम शक्ति के साथ। इस अध्ययन में, हमने निर्धारित किया कि GC376 ने बिल्लियों में अनुकूल जैवउपलब्धता और सुरक्षा का प्रदर्शन किया। प्रायोगिक रूप से एफआईपीवी से संक्रमित बिल्लियों में GC376 का उपयोग करके विवो प्रभावकारिता अध्ययन में, एक नैदानिक ​​चरण में पहुंचने के बाद एंटीवायरल उपचार शुरू किया गया था जो अंततः मौत का कारण होगा। एंटीवायरल उपचार ने नैदानिक ​​संकेतों और लिम्फोपेनिया के तेजी से उलट होने और जलोदर से मैक्रोफेज में वायरल टाइटर्स में कमी का कारण बना। एंटीवायरल उपचार के 14-20 दिनों के बाद सक्रिय संक्रमण स्पष्ट नहीं था और उपचारित बिल्लियां आठ महीने तक लंबे समय तक निरीक्षण में सामान्य रही हैं। ये परिणाम महत्वपूर्ण पहले सबूत प्रदान करते हैं कि 3CLpro अवरोध करनेवाला रोग के विकास को उलटने पर प्रभावी होता है जब प्रयोगात्मक रूप से प्रेरित एफआईपी के एक उन्नत और हमेशा घातक चरण में बिल्लियों को प्रशासित किया जाता है।

बिल्लियों में GC376 का फार्माकोकाइनेटिक्स अध्ययन

GC376 (छवि 1) dipeptidyl संक्रमण राज्य 3CLpro अवरोधकों का एक प्रतिनिधि यौगिक है [28-30, 32] जिसका संश्लेषण पहले वर्णित था [28]। NPI64 GC376 के साथ सजातीय संरचनात्मक तत्वों को साझा करता है, सिवाय इसके कि NPI64 के पास एक स्थिति में GC376 की तुलना में 1-naththylalanine का एक अतिरिक्त अवशेष होता है जो कि Schechter और Berger [33] (छवि 1) के नामकरण का उपयोग करके P3 स्थिति [30] से मेल खाती है। सेल संस्कृति प्रणाली में सेलीन कोरोवायरस की प्रतिकृति के खिलाफ GC376 और NPI64 की तुलनीय एंटीवायरल गतिविधि पहले रिपोर्ट की गई थी (चित्र 1) [28], 30]। हालांकि, उनके पीके संपत्तियों की रिपोर्ट नहीं की गई है। इस अध्ययन में, हमने 10 मिलीग्राम / किग्रा GC376 या 5 मिलीग्राम की एकल चमड़े के नीचे (sc) खुराक के बाद स्वस्थ विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (एसपीएफ) में 6-9 महीने की उम्र (n = 2) की बिल्लियों की दवा प्लाज्मा एकाग्रता में परिवर्तन की जांच की। / किग्रा एनपीआई 64। सीरियल रक्त के नमूने एकत्र किए गए और प्लाज्मा दवा सांद्रता मापा गया। पहले, हमने बताया कि GC376 को बिसल्फाइट समूह के निष्कासन द्वारा एल्डिहाइड के रूप में परिवर्तित किया जाता है, और एल्डिहाइड फॉर्म एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी अध्ययनों [3] में न्यूक्लियोफिलिक सिस्टीन अवशेषों के साथ एक प्रतिवर्ती सहसंयोजक बंधन बनाता है। हमने एनपीआई 64 के रूपांतरण को रक्त में इसके एल्डिहाइड रूप में भी देखा। इसलिए प्लाज्मा नमूनों में GC376 या NPI64 के एल्डिहाइड रूपों को मापा गया। चित्र 2A समय के साथ GC376 (लाल त्रिकोण) या NPI64 (काले घेरे) के एकल-खुराक प्रशासन के बाद प्लाज्मा दवा सांद्रता को दर्शाता है। पीके अध्ययन के परिणामों से संकेत मिलता है कि GC376 s.c के बाद तेजी से अवशोषित होता है। इंजेक्शन के बाद प्रशासन और पीक प्लाज्मा स्तर 2 घंटे के भीतर पहुंच गया था। मतलब प्लाज्मा दवा सांद्रता 18 घंटे के बाद इंजेक्शन (छवि 2 ए, लाल त्रिकोण) के लिए GC376 (8 एनजी / एमएल) के एल्डिहाइड रूप के 50% प्रभावी एकाग्रता (EC50) मूल्य से ऊपर बनी हुई है। 5 मिलीग्राम / किग्रा एनपीआई 64 के इंजेक्शन के बाद प्लाज्मा दवा सांद्रता एनपीआई 64 (12 एनजी / एमएल) के एल्डिहाइड फॉर्म के ईसी 50 मूल्य से ऊपर 12 बजे के बाद इंजेक्शन (छवि 2 ए, काले घेरे) के लिए रुके थे। NPI64 प्रशासन के बाद अधिकतम पाया गया प्लाज्मा दवा एकाग्रता 9.5 गुना गुना GC376 की तुलना में काफी कम था। यह परिणाम बताता है कि GC376 परीक्षण मार्ग के माध्यम से NPI64 की तुलना में अधिक आसानी से अवशोषित किया गया था, तब भी जब GC376 (10 mg / kg) की तुलना में NPI64 (5 mg / kg) की निचली खुराक को ध्यान में रखा गया था।

 ig 1. Chemical structure of 3CLpro inhibitors in cell culture and antiviral activity against Celine virus.

Chemical structures of GC376 and NPI64 are shown. The 50% effective concentration (EC50) values of GC376 or NPI64 against FIPV 3CLpro [28, 30] and the values of 50% cytotoxic concentration (CC50) of GC376 or NPI64 were previously determined in different cell lines [28, 30] And summarized. In a table.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005531.g001

बिल्लियों में GC376 के कई खुराकों का चार सप्ताह का सुरक्षा अध्ययन

पीके अध्ययन में जीसी 376 की खुराक को निर्धारित करने के बाद, जीसी 376 की सुरक्षा का मूल्यांकन 6 से 9 महीने की उम्र के चार स्वस्थ एसपीएफ बिल्लियों में किया गया था। बिल्लियों को 10 मिलीग्राम / किग्रा GC376 के साथ s.c द्वारा प्रशासित किया गया था। 4 सप्ताह के लिए सुबह 9 बजे और शाम 5 बजे दो बार इंजेक्शन। अध्ययन की अवधि के लिए, वे प्रतिकूल प्रभावों के लिए दैनिक देखे गए। रक्त के नमूनों को साप्ताहिक रूप से लिया गया और पूर्ण रक्त गणना और रक्त रसायन पैनल आयोजित किए गए। अध्ययन अवधि के दौरान, महत्वपूर्ण संकेतों और नैदानिक ​​प्रयोगशाला मापदंडों (S1A – S1D अंजीर) में कोई नैदानिक ​​रूप से महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं थे, यह दर्शाता है कि सुरक्षा अध्ययन की अवधि के लिए बिल्लियों में खुराक और GC376 के प्रशासन का मार्ग अच्छी तरह से सहन किया गया था।

सुरक्षा अध्ययन के दौरान, पहले तीन दिनों के लिए 2 और 16 घंटे बाद दवा प्रशासन में अतिरिक्त रक्त के नमूने लिए गए और फिर 4 सप्ताह के लिए साप्ताहिक। 16 घंटे के बाद के प्रशासन में प्लाज्मा दवा सांद्रता अगले दवा प्रशासन से पहले एकत्र रक्त से निर्धारित की गई थी और इस तरह प्लाज्मा में न्यूनतम दवा स्तर का प्रतिनिधित्व करते हैं। परिणाम बताते हैं कि सबसे कम प्लाज्मा दवा सांद्रता EC50 मूल्य (अंजीर 2B काले त्रिकोण) से ऊपर बनी हुई है और उच्चतम निर्धारित दवा सांद्रता CC50 मूल्य से काफी नीचे थी जो सेल संस्कृति में 150 μM से अधिक है (चित्र 2) लाल त्रिकोण )। सुरक्षा और पीके अध्ययन के परिणामों के आधार पर, जीसी 376 की खुराक और प्रशासन मार्ग विवो प्रभावकारिता अध्ययन में उपयुक्त होने के लिए निर्धारित किया गया था।

एफआईपी और एंटीवायरल उपचार के साथ बिल्लियों का प्रायोगिक संक्रमण

गीला FIP प्रेरित करने वाले सीरोटाइप I FIPV के साथ बिल्लियों का प्रयोगात्मक संक्रमण पहले [12, 17, 34] बताया गया है। एफआईपीवी को वायरस न्यूट्रलाइजेशन टेस्ट के आधार पर सेरोटाइप I और II में वर्गीकृत किया गया है। सीरोटाइप I FIPV स्वाभाविक रूप से होने वाले FIP के बहुमत (80-90%) के लिए जिम्मेदार है [10, 35–38]। इस प्रयोगात्मक संक्रमण में, संक्रमण के बाद 2-3 सप्ताह के भीतर एक पूर्ण लिम्फोपेनिया, बुखार, वजन में कमी, पीलिया और हल्के जलोदर के लिए अनुचित है। बढ़ते पीलिया और जलोदर अगले 1 से 3 सप्ताह के दौरान होते हैं। प्रायोगिक संक्रमण के बाद लिम्फोपेनिआ और नैदानिक ​​संकेतों को विकसित करने वाली सभी बिल्लियां अनायास ठीक नहीं होती हैं, लेकिन बीमारी [12, 17, 34] के आगे झुक जाती हैं।

GC376 की प्रभावकारिता की जांच करने के लिए, हमने दो स्वतंत्र अध्ययन किए। इन अध्ययनों में, संक्रमित बिल्लियों द्वारा विशिष्ट लिम्फोपेनिया और नैदानिक ​​लक्षणों का पता लगाने के लिए एंटीवायरल उपचार शुरू किया गया था, ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि जीसी 376 के साथ उपचार लक्षणों की गंभीरता या घातकता को कम करने में प्रभावी है या नहीं। दोनों अध्ययनों में, संक्रमित बिल्लियों को बुखार, शरीर के वजन और जावक रोग के संकेत और लिम्फोसाइट गिनती के लिए साप्ताहिक निगरानी की गई थी। पहले प्रभावकारिता अध्ययन में, 8-10 महीने की उम्र के चार एसपीएफ बिल्लियों (P02, P03, P07 और P10) को एक कैट-पास किए गए सीरोटाइप I FIPV (FIPV-m3c-2) [12, 17, 34] के साथ अंतःक्रियात्मक रूप से प्रशासित किया गया था। । संक्रमण के बाद, उन्होंने 14-20 दिनों के बाद संक्रमण (डीपीआई) (तालिका 1) के भीतर लिम्फोपेनिया और नैदानिक ​​लक्षणों को विकसित किया, जिसमें अनुचित या हल्के जलोदर शामिल हैं। दूसरे अध्ययन में, एक ही वायरस (P15, P16, P17 और P24) के साथ 8–10 महीने की उम्र के चार एसपीएफ बिल्लियों के जलोदर को अधिक गहरा, शास्त्रीय पेट के फैलाव की प्रगति की अनुमति दी गई थी, जो बिल्लियों के समान हैं। स्वाभाविक रूप से होने वाली एफआईपी के साथ अक्सर क्लीनिक में प्रस्तुत किया जाता है (तालिका 1)। हालांकि, पीड़ा को कम करने के लिए, बाद की चार बिल्लियों को एंटीवायरल उपचार से पहले मेलोक्सिकैम, एक गैर-स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवा और चमड़े के नीचे के तरल पदार्थ दिए गए थे। एंटीवायरल ड्रग उपचार शुरू होने से पहले यह सहायक उपचार बंद कर दिया गया था। दोनों अध्ययनों से आठ बिल्लियों ने पीलिया, गहन जलोदर के प्रति असंगत, पूर्ण लिम्फोपेनिया (134 ~ 676 / μl, संदर्भ रेंज 1,200 से 8,000 / μl) और उच्च बुखार (41.1 डिग्री सेल्सियस तक) (छवि 3 बी और 3 डी, तालिका 1) को विकसित किया। एंटीवायरल उपचार शुरू करने से पहले। उन्होंने इसी अवधि (छवि 3 सी) के दौरान अपने पूर्व संक्रमण के वजन का 13.6% तक शरीर का वजन कम किया। जब वे इस अवस्था में पहुँचे, तो दो बार दैनिक एस.सी. 5 से 10 मिलीग्राम / किग्रा / खुराक पर GC376 का प्रशासन शुरू किया गया था। P15 और P16 को छोड़कर इन बिल्लियों का इलाज 14-20 दिनों के लिए किया गया था, जो उनके नैदानिक ​​संकेतों (छवि 3 ए) की गंभीर प्रकृति के आधार पर एंटीवायरल उपचार शुरू करने के बाद 4 और 7 दिनों के बाद ग्रहण किए गए थे। शेष सभी छह बिल्लियों ने रवैया और बुखार के संकल्प (छवि 3 बी) में तेजी से सुधार दिखाया। एंटीवायरल उपचार से पहले सभी बिल्लियों में पाया जाने वाला गहरा पूर्ण लिम्फोपेनिआ भी एक सप्ताह बाद अगले रक्त परीक्षण से पहले सामान्य हो गया (अंजीर 3 डी) और वजन कम हो गया और सामान्य वृद्धि फिर से शुरू हो गई (छवि 3 सी)। पेरिटोनिटिस के जलोदर और अंडकोश की सूजन सूचक भी धीरे-धीरे एंटीवायरल उपचार के एक सप्ताह बाद हल हो गए। 14-20 दिनों के लिए एंटीवायरल उपचार प्राप्त करने वाली सभी बिल्लियों नैदानिक ​​अवलोकन और प्रयोगशाला परीक्षण द्वारा सामान्य दिखाई दीं। दोनों अध्ययनों से छह बरामद बिल्लियों स्वस्थ बनी हुई हैं, जो 8 महीने तक की एक अवलोकन अवधि के दौरान किसी भी प्रकार की बीमारी का संकेत नहीं है। इन प्रयोगों से पता चलता है कि प्रोटीज इनहिबिटर रोग की प्रगति को उल्टा करने में सक्षम था जब उन्नत नैदानिक ​​में उपचार शुरू किया गया था

 अंजीर 3. एफआईपी के साथ रोगसूचक बिल्लियों का एंटीवायरल उपचार।

(ए) दो स्वतंत्र अध्ययनों में, बिल्लियों को 0 दिन एफआईपीवी के साथ टीका लगाया गया था और लिम्फोपेनिया और नैदानिक लक्षणों के विकसित होने के बाद जीसी 376 उपचार शुरू किया गया था। दूसरे अध्ययन में, बिल्लियों को पांच दिनों (छायांकित बक्से) के लिए सहायक उपचार मिला, जिसे एंटीवायरल उपचार से पहले बंद कर दिया गया था। तीर और आगे की स्लैश क्रमशः एंटीवायरल उपचार अवधि और इच्छामृत्यु का संकेत देते हैं। डीपीआई, दिनों के बाद संक्रमण। (बी-डी) एफआईपी के साथ बिल्लियों की प्रतिक्रियाएं एंटीवायरल उपचार के लिए: समय के साथ शरीर का तापमान (बी), प्रतिशत शरीर के वजन में परिवर्तन (सी) और लिम्फोसाइट काउंट्स (डी)। छायांकित क्षेत्र मूल्यों की सामान्य श्रेणी का संकेत देते हैं। पैनल बी और डी के बीच स्थित रंगीन तीर प्रत्येक बिल्ली के लिए उपचार की अवधि का संकेत देते हैं।

एक व्यापक स्पेक्ट्रम कोरोनावायरस प्रोटीज अवरोधक द्वारा बिल्लियों में घातक कोरोनावायरस संक्रमण की प्रगति का उलटा
अंजीर 3

एफआईपी के साथ रोगसूचक बिल्लियों का एंटीवायरल उपचार।

(ए) दो स्वतंत्र अध्ययनों में, बिल्लियों को 0 दिन एफआईपीवी के साथ टीका लगाया गया था और लिम्फोपेनिया और नैदानिक लक्षणों के विकसित होने के बाद जीसी 376 उपचार शुरू किया गया था। दूसरे अध्ययन में, बिल्लियों को पांच दिनों (छायांकित बक्से) के लिए सहायक उपचार मिला, जिसे एंटीवायरल उपचार से पहले बंद कर दिया गया था। तीर और आगे की स्लैश क्रमशः एंटीवायरल उपचार अवधि और इच्छामृत्यु का संकेत देते हैं। डीपीआई, दिनों के बाद संक्रमण। (बी-डी) एफआईपी के साथ बिल्लियों की प्रतिक्रियाएं एंटीवायरल उपचार के लिए: समय के साथ शरीर का तापमान (बी), प्रतिशत शरीर के वजन में परिवर्तन (सी) और लिम्फोसाइट काउंट्स (डी)। छायांकित क्षेत्र सामान्य रूप से चलने का संकेत देते हैं

एक व्यापक स्पेक्ट्रम कोरोनावायरस प्रोटीज अवरोधक द्वारा बिल्लियों में घातक कोरोनावायरस संक्रमण की प्रगति का उलटा

एंटीवायरल उपचार ने एफआईपी के साथ बिल्लियों में वायरल लोड को काफी कम कर दिया

चूंकि एफआईपीवी ऊतकों के साथ अत्यधिक जुड़ा हुआ है और एफआईपी [17] के साथ बिल्लियों में उच्च स्तर पर रक्त में दृढ़ता से नहीं पाया जाता है, वायरल लोड को कम करने में एंटीवायरल दवाओं की प्रभावशीलता का आकलन जीवित जानवरों में कठिनाई पैदा करता है। हालाँकि जलोदर से एक्सयूडेट मैक्रोफेज के वायरस टाइटर्स को मापने से एफआईपीवी की प्रतिकृति के खिलाफ एंटीवायरल दवा के प्रभाव को निर्धारित करने की अनुमति मिलती है, जलोदर तेजी से एंटीवायरल उपचार के साथ कम हो गया और हम बरामद बिल्लियों में जलोदर एकत्र करने में सक्षम नहीं थे। हालांकि, हमने एंटीवायरल उपचार से पहले और दौरान दूसरे अध्ययन (P15 और P16) से दो बिल्लियों में वायरल लोड का निर्धारण किया। इन बिल्लियों को एंटीवायरल उपचार के 4 और 7 दिनों के बाद इच्छामृत्यु किया गया था। परिगलन पर, दोनों बिल्लियों को गंभीर अग्नाशयशोथ था, मेलॉक्सिकैम उपचार की एक संभावित जटिलता, लेकिन एफआईपी के कोई घाव (पी 16) या हल्के घाव (पी 15) ठेठ नहीं पाए गए थे। जलोदर से मैक्रोफेज में वायरस टाइटर्स वास्तविक समय मात्रात्मक आरटी-पीसीआर द्वारा निर्धारित किए गए थे और सीटी मानों का विश्लेषण तुलनात्मक सीटी विधि द्वारा [-एक्टिन को संदर्भ जीन [39] के रूप में किया गया था। परिणामों से पता चला कि जलोदर से मैक्रोफेज में वायरल आरएनए स्तर इन बिल्लियों में एंटीवायरल उपचार की अवधि के साथ कम हो गया है। डेल्टा डेल्टा सीटी सीटी विधि का उपयोग करके वायरल आरएनए स्तर की तह कमी 1,595.7 पी 15 थी जिसमें पूर्व की तुलना में 7 दिन-एंटीवायरल उपचार (छवि 4 बी) प्राप्त पी 16 में 4 दिन-एंटीवायरल उपचार (छवि 4 ए) और 171,755.9 प्राप्त हुआ। प्रत्येक बिल्ली के मैक्रोफेज में उपचार वायरल आरएनए स्तर। जलोदर से मैक्रोफेज में वायरल आरएनए स्तर (2-alCt) को अंजीर में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। P15 और P16 के omentum में वायरल आरएनए स्तर को अंजीर 4C में भी दिखाया गया है। इन परिणामों के आधार पर, P15 और P16 में वायरस के टाइटर्स में कमी उन बिल्लियों में हल्के या बिना एफआईपी घावों के नेक्रोपसी निष्कर्षों के साथ सहसंबंधित लगती है। वायरल टाइटर्स पर ये नतीजे बताते हैं कि FIPV 3CLpro FIPV एंटीवायरल ड्रग्स के लिए एक वैध लक्ष्य है और GC376 जलोदर से बिल्लियों में वायरस के भार और FIP से बिल्लियों की अपरिपक्वता को प्रभावी ढंग से कम कर सकता है।

अंजीर 4. एंटीवायरल उपचार से पहले और दौरान P15 और P16 में वायरल आरएनए स्तरों में परिवर्तन।

(A और B) समय के साथ P15 (A) और P16 (B) के जलोदर से मैक्रोफेज में वायरल आरएनए गुना परिवर्तन दिखाया गया है। वायरल आरएनए रियल-टाइम qRT-PCR से सीटी मान को from-एक्टिन के लिए सामान्यीकृत किया गया था और 2-2Ct विधि का उपयोग पूर्व-उपचार मूल्य की तुलना में वायरल आरएनए स्तर में सापेक्ष परिवर्तन की गणना करने के लिए किया गया था। (सी) वायरल आरएनए स्तर (2-)Ct) पी 15 और पी 16 के ओमेंटम में जो क्रमशः एंटीवायरल उपचार के 4 और 7 दिनों के बाद एकत्र किए जाते हैं। बार ग्राफ वायरल आरएनए रीयल-टाइम qRT-PCR से β-एक्टिन तक सीटी मानों को सामान्य करके 2-2Ct मानों की गणना करता है। (डी) पूर्व-उपचार में और उपचार के दौरान P15 और P16 के जलोदर से मैक्रोफेज में प्रत्येक वायरल आरएनए के लिए 2-tCt मान तालिका में सूचीबद्ध हैं। एन / ए, उपलब्ध नहीं।

GC376 और NPI52 प्रतिरोधी FIPV के इन विट्रो चयन की तुलना

जीसी 376 या एनपीआई 52 (एनपीआई 64 का एक एल्डिहाइड रूप) की उपस्थिति में क्रैन्डेल रीस फेलिन किडनी (सीआरएफके) कोशिकाओं में एफआईपीवी -1146 के सीरियल मार्ग को दवा के दबाव में वायरल प्रतिरोध के उद्भव की तुलना करने के लिए आयोजित किया गया था। पास नंबर 10 पर, एफआईपीवी के खिलाफ एनपीआई 52 का ईसी 50 मान 15-गुना बढ़ गया, जबकि एक ही मार्ग संख्या में जंगली प्रकार के वायरस की तुलना में। हालांकि, एफआईपीवी के खिलाफ जीसी 376 की एंटीवायरल गतिविधि में कमी 20 मार्ग तक नहीं देखी गई। 10 पास से एकत्र NPI52 प्रतिरोधी FIPV वायरस के 3CLpro जीन के अनुक्रम विश्लेषण ने 131 की स्थिति में सेरिन को सेरीन का एक एकल उत्परिवर्तन प्रकट किया, जो कि डोमेन II (S2A Fig) में β-किस्में cII और dII के बीच स्थित है। । चूंकि ये यौगिक समान संरचना साझा करते हैं, इसलिए हमने यह भी जांच की कि क्या एनपीआई 52 प्रतिरोधी वायरस जीसी 376 के लिए संवेदनशीलता बनाए रखते हैं। GC376 ने सेल संस्कृति में NPI52-प्रतिरोधी वायरस की प्रतिकृति को जंगली-प्रकार के वायरस के रूप में प्रभावी रूप से बाधित किया, यह दर्शाता है कि उत्परिवर्तन GC376 के लिए क्रॉस-प्रतिरोध को प्रदान नहीं करता है।

वह 3CLpro अवरोधक, GC376, प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) परख में MERS-CoV और SARS-CoV के 3CLpro के खिलाफ सक्रिय है

कोरोनावायरस 3CLpro उनकी संरचना और सक्रिय साइट [28, 40, 41] में अत्यधिक संरक्षित हैं। S2A Fig MERS-CoV (PDB ID: 4WME, teal) [40] और FIPV (लाल) TGEV 3CLpro (PDB ID: 4F49) [28] के आधार पर तैयार की गई 3CLpro संरचनाओं को दर्शाता है। TGEV और FIPV के 3CLpro को> 93% के एमिनो एसिड अनुक्रम पहचान के साथ अत्यधिक संरक्षित किया जाता है। हालांकि, TGEV के 3CLpro, MERS-CoV और SARS-CoV में कम अमीनो एसिड अनुक्रम की पहचान लगभग 50% है। बहरहाल, वे समग्र संरचना (S2A अंजीर) को अच्छी तरह से संरक्षित करते हैं। GC376 की गतिविधि पहले SARS-CoV के 3CLpro के खिलाफ FRET परख [28] का उपयोग करके बताई गई थी। हालांकि, MERS-CoV और FIPV के 3CLpro के खिलाफ इसकी गतिविधि अज्ञात है। इसलिए, हमने क्लोन किया और FIPV और MERS-CoV की पूर्ण लंबाई 3CLpro को व्यक्त किया, जो पहले वर्णित प्रक्रियाओं के अनुसार था [28]। आंकड़े 5 में संक्षेप हैं। डेटा बताते हैं कि GC376 FRET परख द्वारा FIPV 3CLpro के खिलाफ सबसे प्रभावी था, लेकिन इसने MERS-CoV और SARS-CoV 3CLpro की गतिविधि को भी काफी हद तक रोक दिया।

अंजीर। 5. प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) परख में विभिन्न कोरोनाविरस के 3CLpro के खिलाफ GC376 की गतिविधि।

ऊपरी ग्राफ़ एफसीईटी परख द्वारा निर्धारित जीसी 376 की उपस्थिति में एफआईपीवी, एसएआरएस-सीओवी, और एमईआरएस-सीओवी की 3CLpro की प्रतिशत गतिविधि को दर्शाता है। निम्न तालिका 3CLpro के खिलाफ GC376 के 50% निरोधात्मक एकाग्रता (IC50) मूल्यों को संक्षेप में प्रस्तुत करती है

विचार-विमर्श

चूंकि एफआईपी रोग की प्रगति काफी तेज है और एफआईपी की रोगजनन मुख्य रूप से प्रतिरक्षा-मध्यस्थता है, इसलिए एक महत्वपूर्ण सवाल अनुत्तरित है कि क्या एंटीवायरल ड्रग उपचार रोगसूचक मेजबानों में रोग प्रगति को प्रभावी रूप से उलट सकता है। यह पहले दिखाया गया था कि विरोधी भड़काऊ एजेंट या एंटीवायरल इम्युनिटी बढ़ाने वाले एजेंटों ने चूहे-अनुकूलित SARS-CoV से संक्रमित चूहों की उत्तरजीविता बढ़ाई और एक NF-kB अवरोधक [42] या विभिन्न टोल-जैसे रिसेप्टिक एगोनिस्ट के साथ इलाज किया [31, 42-44] ], जिसे वायरस के संक्रमण के कुछ समय पहले या बाद में शुरू किया गया था। इन रिपोर्टों से संकेत मिलता है कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करना कोरोनावायरस संक्रमणों के लिए एक प्रभावी चिकित्सीय रणनीति साबित हो सकती है जहां सूजन रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। हालांकि, एंटीवायरल यौगिकों की प्रभावकारिता पर उपलब्ध आंकड़े माउस-अनुकूलित SARS-CoV से संक्रमित चूहों में पर्याप्त प्रभाव दिखाने में विफल रहे, यहां तक ​​कि जब एक ही समय में या वायरस के संक्रमण के तुरंत बाद उपचार शुरू किया गया था [31, 43]। एंटीवायरल उपचार की मनाया गई कम प्रभावशीलता को मोटे तौर पर कमजोर एंटी-कोरोनावायरस गतिविधि और / या जैवउपलब्धता के साथ यौगिकों के उपयोग के कारण माना जाता है। हालांकि, कोरोनवीर के खिलाफ उपलब्ध प्रबल एंटीवायरल यौगिकों की कमी ने घातक कोरोनोवायरस संक्रमण वाले जानवरों में एंटीवायरल उपचार के प्रभावों की जांच करना मुश्किल बना दिया है। हमारे 3CLpro अवरोधकों को पहले इन विट्रो assays में FIPV के खिलाफ शक्तिशाली होने की सूचना दी गई थी [28, 30] और MHV [30] से संक्रमित चूहों में वायरल टाइटर्स और ऊतक विकृति को कम करने में प्रभावी। हालांकि, बिल्लियों में इन 3CLpro अवरोधकों का परीक्षण नहीं किया गया है। इस अध्ययन में, एक 3CLpro अवरोध करनेवाला, GC376, बिल्लियों में अच्छी जैवउपलब्धता के साथ सुरक्षित होने के लिए निर्धारित किया गया था। एफआईपी के साथ बिल्लियों का उपयोग करके विवो प्रभावकारिता अध्ययन में, नैदानिक ​​रूप से उन्नत चरणों में बिल्लियों के लिए एंटीवायरल उपचार शुरू हुआ, जिससे लिम्फोसाइटों की संख्या का तेजी से सामान्यीकरण हुआ, जिसके दौरान, बुखार, पीलिया और जलोदर भी हल हो गए। आमतौर पर एफआईपीवी से संक्रमित बिल्लियों में विभिन्न अंगों में पाए जाने वाले ग्रैनुलोमैटस घाव दो बिल्लियों में नहीं पाए गए थे या बहुत कम हो गए थे, जो एंटीवायरल उपचार के केवल 4 और 7 दिनों के बाद इच्छामृत्यु किए गए थे। ये परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि FIP की प्रतिरक्षा-मध्यस्थता रोगजनन की प्रगति में निरंतर वायरस प्रतिकृति महत्वपूर्ण है और कोरोनोवायरस 3CLpro को सीधे-सीधे एंटीवायरल यौगिक लक्ष्यीकरण द्वारा वायरस प्रतिकृति को नियंत्रित करना एफआईपी रोग को उलटने में प्रभावी है। हमारे परिणाम हमारे सर्वोत्तम ज्ञान को पहला प्रमाण प्रदान करते हैं, कि एक प्रत्यक्ष-अभिनय एंटीवायरल एजेंट कोरोनोवायरस संक्रमण के कारण प्रतिरक्षा-मध्यस्थता रोग प्रगति को उलटने में प्रभावी है, तब भी जब चिकित्सीय उन्नत चरणों में एंटीवायरल उपचार शुरू किया गया था। इस खोज का अन्य कोरोनावायरस संक्रमणों के लिए प्रभावी चिकित्सीय रणनीतियों को तैयार करने में महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है।

कोरोनावायरस 3CLpro के संरक्षित सक्रिय स्थल को कोरोनावायरस संक्रमण [7, 45] और हमारे समूह [28] और अन्य [8, 46, 47] के लिए व्यापक स्पेक्ट्रम अवरोधकों के डिजाइन के लिए एक आशाजनक लक्ष्य माना जाता है। 3 कोरप्रो अवरोधकों के साथ कई कोरोनवीर के खिलाफ एंटीवायरल गतिविधि। GC376 को सेल संस्कृति में FIPV के खिलाफ सक्रिय होने के लिए पहले दिखाया गया था [28, 30] और SARS-CoV 3CLpro को FRET परख [28] में। इस अध्ययन में, हमने एफसीईटी परख द्वारा एफआईपीवी के 3CLpro, MERS-CoV और SARS-CoV के खिलाफ GC376 की गतिविधि की तुलना की और निर्धारित किया कि GC376 में FIPV के 3CLpro के खिलाफ सबसे शक्तिशाली गतिविधि है। MERS-CoV और SARS-CoV के विरुद्ध GC376 का IC50 मान क्रमशः 2.16 और 4.87-गुना था, जो FRET परख में FIPV के मुकाबले अधिक था। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि GC376 अल्फाकोरोनवायरस (FIPV) से संबंधित कोरोनविर्यूज़ के 3CLpro या बिटाकॉनोवायरस (MERS-CoV और SARS-CoV) में कई क्लोनों के बावजूद सक्रिय है, FIPV, SARS-CoV और MERS के बीच 3CLpro की कम अनुक्रम पहचान के बावजूद। -CoV। 3 कोरप्रोविर के 3Lpro के खिलाफ GC376 की प्रभावशीलता की बदलती डिग्री कोरोनोवायरस 3CLpro (S2B और S2C अंजीर) के सक्रिय स्थल में यौगिक के स्थानिक संरचना में एक सूक्ष्म अंतर को दर्शा सकती है। हालांकि, इन मानव कोरोनविर्यूज़ की प्रतिकृति के खिलाफ GC376 की एंटीवायरल गतिविधि अभी तक सेल संस्कृति या पशु मॉडल में निर्धारित नहीं की गई है।

एंजाइम प्रोटे में विभिन्न कोरोनविर्यूज़ के खिलाफ निरोधात्मक प्रभाव दिखाने के लिए दिखाए गए अधिकांश प्रोटीज़ अवरोधकों में ट्रिप्टेप्टिडिल या बल्कियर कंपाउंड [8, 48–51] हैं और सेल संस्कृति या विवो गुणों में उनकी एंटीवायरल गतिविधियां अक्सर उपलब्ध नहीं होती हैं। इस अध्ययन में, हमने dipeptidyl और tripeptidyl 3CLpro अवरोधकों के उपचर्म अवशोषण की तुलना की। GC376, एक dipeptidyl मिश्रित, एक वारहेड, एक स्थिति में एक Gln surrogate संरचना है जो P1 स्थिति, P2 स्थिति में ल्यू और एक टोपी संरचना [28] (छवि 1) से मेल खाती है। NPI64, एक ट्रिपेप्टिडिडिल यौगिक, GC376 के साथ सजातीय संरचनात्मक तत्व हैं, सिवाय इसके कि NPI52 में 1-नाथथाइलेनिन (चित्र 1) का एक अतिरिक्त अवशेष है। इन दोनों यौगिकों में सेल संस्कृति में FIPV के खिलाफ तुलनीय एंटीवायरल गतिविधि होती है (चित्र 1) [30]। हालांकि, NPI64 के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन के बाद शिखर प्लाज्मा एकाग्रता GC376 की तुलना में काफी कम था, जो इंगित करता है कि GC376 चमड़े के नीचे के मार्ग के माध्यम से NPI64 से बेहतर अवशोषित होता है। इन निकट संबंधी यौगिकों पर हमारे परिणाम संकेत करते हैं कि अपेक्षाकृत छोटे संरचनात्मक परिवर्तन (एक अवशेषों के अलावा) का अवशोषण में गहरा प्रभाव हो सकता है, और इसलिए दवा चयन प्रक्रिया के दौरान यौगिकों की जैव उपलब्धता को ध्यान में रखा जाना चाहिए। GC376 भी दो बार दैनिक प्रशासन के 4 सप्ताह की अवधि के दौरान बिल्लियों में अच्छी तरह से सहन किया गया था, EC50 मूल्य से ऊपर लेकिन अच्छी तरह से CC50 मूल्य से नीचे प्लाज्मा दवा सांद्रता के साथ।

एंटीवायरल थेरेपी में वायरल प्रतिरोध का उभरना एक प्रमुख चिंता है। प्रोटीज इनहिबिटर-प्रतिरोधी कोरोनावायरस पर केवल उपलब्ध साहित्य [52] ने बताया कि एक 3CLpro अवरोधक (GRL-001) MHV के लिए एक कम आनुवंशिक बाधा है। उस अध्ययन में, सेल संस्कृति में अवरोधक की उपस्थिति में 4 मार्ग संख्याओं में प्रतिरोधी वायरस का चयन किया गया था, लेकिन चूहों में प्रतिरोधी वायरस को अत्यधिक देखा गया था। हमारे 3CLpro अवरोधकों के खिलाफ वायरल प्रतिरोध के विकास का अध्ययन करने के लिए, हमने मिक (वाहन), GC376 या NPI64 के एल्डिहाइड फॉर्म (NPI52) की उपस्थिति में FIPV को क्रमिक रूप से पारित कर दिया। पास 10 पर, NPI52 के EC50 मान में 15 गुना वृद्धि हुई, NPI52 के बिना पारित जंगली प्रकार के वायरस की तुलना में, NPI52 प्रतिरोधी वायरस के उद्भव का संकेत दिया गया। NPI52- प्रतिरोधी वायरस के 3CLpro जीन में S131C का एकल उत्परिवर्तन होता है जो कि II और SIIA के बीच डोमेन II (S2A Fig) में स्थित होता है। एनपीआई 52 के प्रतिरोध को व्यक्त करने में 3CLpro में इस उत्परिवर्तन की भूमिका वर्तमान में स्पष्ट नहीं है। हालाँकि, इस स्थिति में सेरीन को सभी फ़लाइन कोरोनावीरस के बीच संरक्षित किया जाता है, जिनके अनुक्रम उपलब्ध हैं और यह कि C144, सक्रिय साइट अवशेष जो अवरोधक के वारहेड के साथ एक सहसंयोजक बंधन बनाता है, CII और S131 के बीच समान लूप पर है। dII स्ट्रैंड्स (S2A अंजीर) का सुझाव है कि यह उत्परिवर्तन लूप की रचना और प्रोटियोलिसिस के लिए सक्रिय साइट के अवशेषों की स्थिति को प्रभावित कर सकता है। दिलचस्प बात यह है कि Deng et al [52] ने यह भी बताया कि MHCL के 3CLpro पर उत्परिवर्तन में से एक जो GRL-001 के लिए आंशिक रूप से प्रतिरोधी है, उत्प्रेरक साइट से दूर स्थित है, लेकिन ऐसी स्थिति में जो उत्प्रेरक साइट के विरूपण को प्रभावित कर सकता है। एनपीआई 52 के विपरीत, जीसी 376 के खिलाफ प्रतिरोधी वायरस को 20 मार्ग तक नहीं चुना गया है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि इसी तरह संरचित यौगिकों में कोरोनवायरस 3CLpro के खिलाफ प्रतिरोध अवरोध के विभिन्न स्तर हो सकते हैं। दिलचस्प है, NPI52- प्रतिरोधी वायरस सेल संस्कृति में GC376 के लिए संवेदनशीलता को नहीं खोते हैं, यह दर्शाता है कि यह उत्परिवर्तन क्रॉस-प्रतिरोध को सम्मानित नहीं करता है। इन अवरोधकों के प्रतिरोध विकास में अंतर्निहित अंतरों को परिभाषित करने की आवश्यकता है, लेकिन यह अनुमान लगाया जा सकता है कि NP37 के मुकाबले GC376 के छोटे आकार, सब्सट्रेट क्लीवर क्षमता को बनाए रखते हुए वायरस को ड्रग बाइंडिंग से बचाना मुश्किल बनाता है। वर्तमान में हम प्रतिरोधी विषाणुओं के सापेक्ष वायरल फिटनेस और एनपीआई 52 के प्रतिरोध को दर्शाने में उत्परिवर्तन की भूमिका की जांच कर रहे हैं।

सारांश में, हमारे डायपेप्टिडाइल 3CLpro अवरोधक श्रृंखला का एक प्रतिनिधि यौगिक, GC376, बिल्लियों में इस्तेमाल की जाने वाली खुराक की खुराक द्वारा सुरक्षित दिखाया गया था और उन्नत नैदानिक चरणों में उपचार शुरू होने पर भी FIP की प्रगति को उलट रहा था। इन परिणामों के आधार पर, इस यौगिक में FIP के लिए एक सुरक्षित और प्रभावी दवा के रूप में विकसित होने की क्षमता हो सकती है। इसके अलावा, MERS-CoV और SARS-CoV सहित महत्वपूर्ण मानव कोरोनवीयरस के खिलाफ इस यौगिक की व्यापक गतिविधि, यह सुझाव देती है कि हमारी अवरोधक श्रृंखला उन महत्वपूर्ण वायरस के लिए आगे अनुकूलन के लिए एक मंच के रूप में काम कर सकती है। इस अध्ययन के परिणाम यह भी बताते हैं कि इसी तरह के हस्तक्षेप अन्य मौजूदा और उभरते कोरोनावायरस संक्रमणों के लिए वायरल-एन्कोडेड 3CLpro वारंट जांच को लक्षित करते हैं।

सामग्री और तरीके
प्रायोगिक बिल्लियाँ

सबसे आम बिल्ली के समान रोगजनकों से मुक्त बेतरतीब नस्ल बिल्लियों, जिसमें बिल्ली के समान एंटेरोन कोरोवावायरस शामिल हैं, को फ़लाइन पोषण प्रजनन कॉलोनी, स्कूल ऑफ़ वेटरनरी मेडिसिन, यूसी डेविस से प्राप्त किया गया था।

नैतिक वक्तव्य

सभी पशु प्रयोगों को पशु कल्याण अधिनियम, PHS नीति और जानवरों से संबंधित अन्य संघीय विधियों और नियमों के साथ सख्त अनुपालन में आयोजित किया गया और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, डेविस (प्रोटोकॉल संख्या: 17557) में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।
जीसी 376 का संश्लेषण

GC376 और NPI64 के संश्लेषण को पहले हमारे समूह [28, 53] द्वारा वर्णित किया गया था।

पीके और सुरक्षा अध्ययन

एकल-खुराक पीके अध्ययन में, 6-9 महीने की उम्र के दो स्वस्थ एसपीएफ़ बिल्लियों (प्रत्येक यौगिक के लिए एन = 2) को सूक्ष्म रूप से 10 मिलीग्राम / किग्रा जीसी 376 या 5 मिलीग्राम / किग्रा एनपीआई 64 के साथ इंजेक्ट किया गया, जो 10% एनएओएचओ और 90% में भंग हुआ। PEG400। प्रत्येक बिल्ली से 2, 6, 12, 18, 24, 30, और इंजेक्शन और प्लाज्मा नमूनों के बाद 48 घंटे में रक्त के नमूने तैयार किए गए थे। प्लाज्मा दवा सांद्रता को फ्रंटेज लैबोरेटरीज, इंक (एक्सटन, पीए) द्वारा नियमित उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके मापा गया था। सुरक्षा (एकाधिक-खुराक) अध्ययन में, 6-9 महीने की उम्र के चार स्वस्थ एसपीएफ़ बिल्लियों को एससी इंजेक्शन लगाया गया। GC376 की दैनिक खुराक (10 मिलीग्राम / किग्रा / खुराक 10% EtOH में भंग, 50% PEG400 और 40% पीबीएस) पर 9AM और 5 PM 4 सप्ताह के लिए। पहले तीन दिनों के लिए और उसके बाद 4 सप्ताह के लिए दवा प्रशासन के बाद 2 या 16 बजे (अगली खुराक से पहले) पर दवा सांद्रता के निर्धारण के लिए प्लाज्मा के नमूने तैयार किए गए थे। सुरक्षा अध्ययन से प्लाज्मा दवा सांद्रता का मापन भी फ्रंटेज लेबोरेटरीज, इंक द्वारा किया गया था। सुरक्षा अध्ययन के दौरान, प्रतिकूल प्रभावों के लिए बिल्लियों की रोजाना दो बार निगरानी की गई और शरीर के वजन को रोजाना मापा गया। GC376 की पहली खुराक से पहले और उसके बाद साप्ताहिक रूप से, प्रत्येक बिल्ली से पूरी रक्त गणना और रक्त रसायन परीक्षण के लिए रक्त के नमूने एकत्र किए गए थे।

विवो प्रभावकारिता अध्ययन में

दो स्वतंत्र रूप से किए गए अध्ययनों में 8 से 10 महीने की उम्र की कुल आठ महिला या पुरुष एसपीएफ बिल्लियाँ मूल रूप से एफआईपीवी संक्रमण [54] के लिए संवेदनशीलता / प्रतिरोध में आनुवंशिकी की भूमिका के विषय में एक अन्य प्रकाशित प्रयोग का हिस्सा थीं। उस अध्ययन में, बिल्लियों को कैट-पास किए गए सीरोटाइप I फ़ील्ड तनाव FIPV-m3c-2 के साथ टीका लगाया गया था। नैदानिक ​​और प्रयोगशाला के संकेतों को विकसित करने वाली बिल्लियों में एफआईपी के उदर प्रवाह (गीला) के साथ संगत और इस बिंदु पर प्रगति हुई कि वे अनिवार्य रूप से घातक होंगे, आठ बिल्लियों को दवा प्रभावकारिता अध्ययन में स्थानांतरित किया गया था। पहले अध्ययन में चार बिल्लियों (P02, P03, P07 और P10) को GC376 के अलावा कोई दवा नहीं मिली। दर्द और निर्जलीकरण के उन्मूलन के लिए दूसरे अध्ययन में मौखिक या उपचर्म meloxicam की पांच खुराक 0.3 मिलीग्राम / किग्रा / खुराक (दिन में एक बार) के साथ-साथ तरल पदार्थ चार बिल्लियों (P15, P16, P17 और P24) को दिए गए। एंटीवायरल उपचार शुरू किया गया था। GC376 को 10% EtOH, 50% PEG400 और 40% पीबीएस में भंग किया गया। s.c. 1420 दिनों के लिए सुबह 9 बजे और शाम 5 बजे। P03 और P07 को क्रमशः 4 या 8 दिनों के लिए 5 मिलीग्राम / किग्रा / खुराक पर GC376 दिया गया, और एंटीवायरल उपचार के अंत तक खुराक को 10 मिलीग्राम / किग्रा / खुराक तक बढ़ा दिया गया। P15 और P16 को क्रमशः 4 और 7 दिनों के एंटीवायरल उपचार के बाद euthanized किया गया था। अन्य सभी बिल्लियों ने एंटीवायरल उपचार के दौरान 10 मिलीग्राम / किग्रा / खुराक पर GC376 प्राप्त किया। जानवरों को नैदानिक ​​संकेतों और शरीर के वजन के लिए दैनिक देखा गया था और लिम्फोसाइट गिनती के लिए रक्त साप्ताहिक एकत्र किया गया था। वास्तविक समय की मात्रात्मक आरटी-पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) द्वारा वायरस अनुमापन के लिए पी 15 और पी 16 से एंटीवायरल उपचार से पहले और उसके दौरान कई बार जलोदर एकत्र किए गए थे। नेक्रोपसी पर पी 15 और पी 16 से ओमेंटम नमूने एकत्र किए गए थे।

वास्तविक समय qRT-PCR द्वारा वायरस की मात्रा

जलोदर और ओमेंटम से मैक्रोफेज में वायरस टाइटर्स वास्तविक समय qRT-PCR द्वारा निर्धारित किए गए थे। पी 15 और पी 16 से एकत्र किए गए जलोदर (1 मिलीलीटर) को पीबीएस में 1: 5 पर 10 इकाइयों / एमएल हेपरिन युक्त पतला किया गया था। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सेल छर्रों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए 500 μl आरएनएलेटर (लाइफ टेक्नोलॉजीज, एनवाई, यूएसए) के साथ जोड़ा गया। सेल छर्रों को centrifugation द्वारा एकत्र किया गया था और विश्लेषण तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। कुल आरएनए निष्कर्षण से पहले, पीबीएस के 200 μl को सेल छर्रों में जोड़ा गया था। ओमेंटम को 0.5 सेमी से कम आकार में काटा गया और आरएनएलेटर के 5 संस्करणों में रखा गया। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ऊष्मायन के बाद, नमूने सतह पर तैरनेवाला हटाने के लिए 13,000 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए centrifuged थे और ऊतकों को -70 डिग्री सेल्सियस पर विश्लेषण तक संग्रहीत किया गया था। कुल आरएनए को जलोदर से मैक्रोफेज से निकाला गया था और आरनेसी मिनी किट (लाइफ टेक्नोलॉजीज) का उपयोग करके ओमेंटम और वास्तविक समय qRT-PCR आयोजित किया गया था। प्राइमरों और FIPV के 3'-UTR क्षेत्र को लक्षित करने वाली एक जांच 5'-GGAGGTACAAGCAACCCTATT-3 '(एक आगे का प्राइमर), 5'-GATCCAGACGTACCTT CTTCC-3' (एक रिवर्स प्राइमर) और FAM-AGATCCGCTATGACACACAGAGCCA है। जांच)। नमूनों में वायरल आरएनए के सापेक्ष स्तरों की गणना तुलनात्मक सीटी पद्धति [39] द्वारा एक संदर्भ जीन के रूप में बीटा एक्टिन का उपयोग करके की गई थी। एंटीवायरल उपचार के दौरान एकत्र किए गए जलोदर में मैक्रोफेज में वायरल आरएनए स्तर में तह परिवर्तन की गणना एंटीवायरल उपचार से पहले एकत्र किए गए मैक्रोफेज नमूनों में वायरल आरएनए स्तर का उपयोग करके की गई थी।

जीसी 376 और एनपीआई 52 के लिए प्रतिरोधी वायरस उत्पन्न करने के लिए एफआईपीवी के सीरियल मार्ग

जीसी 376 या एनपीआई 52 की उपस्थिति में जंगली-प्रकार एफआईपीवी -1146 का उपयोग करके इन विट्रो मार्ग प्रयोगों में अनुक्रमिक प्रतिरोधी वायरस का चयन करने के लिए प्रदर्शन किया गया था। संक्षेप में, CRFK सेल 0.55–1 की उपस्थिति में FIPV से GC56 या NPI52 की उपस्थिति में 0.5 ~ 3 μM से संक्रमित थे। प्रत्येक मार्ग पर, जीसी 376 या एनपीआई 52 की उपस्थिति में वायरस युक्त सतह पर तैरने वालों को ताजी कोशिकाओं में पारित किया गया। एक ही प्रक्रिया के बाद दवा के अभाव में नियंत्रण नकली वायरस पारित किया गया था। कुछ निश्चित संख्याओं पर वायरस टाइटर्स 50% टिशू कल्चर संक्रामक खुराक परख द्वारा निर्धारित किए गए थे और वाइल्ड-टाइप वायरस के सापेक्ष EC50 मूल्यों में गुना परिवर्तन निर्धारित किए गए थे। NPI52 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में 10 मार्ग के बाद, RNeasy Mini kit (Invitrogen) का उपयोग करके कुल वायरल RNA को अलग किया गया और RTCL-PCR द्वारा प्रवर्धन के बाद 3CLpro जीन को अनुक्रमित किया गया और उत्परिवर्तन की उपस्थिति के लिए विश्लेषण किया गया। मार्ग संख्या 10 पर दवा (मॉक) या एनपीआई 52 प्रतिरोधी वायरस के बिना उगाए गए वायरस को कमजोर पड़ते हुए [55] सीमित करके तीन बार शुद्ध किया गया था।

यह जांचने के लिए कि क्या NPI52 प्रतिरोधी वायरस GC376 के लिए अतिसंवेदनशील हैं, GC376 या NPI52 के धारावाहिक dilutions 24-अच्छी तरह से प्लेटों या कोशिकाओं में CRFK कोशिकाओं के संगम monolayers में जोड़े गए थे, मॉक-उपचार किया गया था और कोशिकाओं को तुरंत NPI52 प्रतिरोधी वायरस से संक्रमित किया गया था। 0.05-1 का एक एमओआई। 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के बाद जब तक मॉक-ट्रीटेड वेल (36 घंटे तक) में एक व्यापक साइटोपैथिक प्रभाव नहीं देखा गया, तब तक वायरस टिट्रेशन के लिए कोशिकाओं को फ्रीज किया गया। EC50 मूल्यों को पहले [२।, ३०] वर्णित प्रक्रियाओं के बाद ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ्टवेयर संस्करण ६ (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर, सैन डिएगो, सीए) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था।

3CLpro की अभिव्यक्ति

FIPV-m3c-2 की पूरी लंबाई 3CLpro कूटबन्धन कोडन-अनुकूलित cDNA को RIP-PCR द्वारा FIPV-m3c-2 से संक्रमित बिल्लियों से omentum ऊतक का उपयोग करके प्रवर्धित किया गया था। SARS-CoV (GenBank: GU553365.1) और MERS-CoV (GenBank: KM210277) को GenScript (Piscataway, NJ) द्वारा संश्लेषित किया गया था। प्रत्येक 3CLpro की अभिव्यक्ति और शुद्धि हमारे समूह द्वारा पहले वर्णित एक मानक विधि के बाद आयोजित की गई थी [28]। MERS 3CLpro के लिए प्राइमर हैं; फारवर्ड प्राइमर (ATTCTAGAAAGGAGATATACCATGCAT CATCATCATCATCATCATGGTCTGGTTAAAATGAGCC) और रिवर्स प्राइमर (ATCTCGAGTCACTATATCACACACACCCATAATC)। FIPV 3CLpro के लिए प्राइमर हैं; फारवर्ड प्राइमर (ATTCTAGAAAGGAGATATACCATGCATCATCATCATCATCATCATTCTG GATTGCGAAAAATGGC) और रिवर्स प्राइमर (ATCTCGAGGCGGSTGCTCACTGACT)।

झल्लाहट परख

SARS-CoV [28] के वायरल पॉलीप्रोटीन पर दरार वाली साइटों से निकले एक फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट (डबसेल-केटीएसएवीएलक्यू / एसजीएफआरकेएमई-एडंस) का उपयोग करके एफआरईटी परख का प्रदर्शन किया गया था और इसे जेनस्क्रिप्ट द्वारा संश्लेषित किया गया था। एफआरईटी परख के लिए तरीके पहले हमारे समूह [28, 30] द्वारा वर्णित किए गए थे। संक्षेप में, FRET परख में, FIPV के 3CLpro, MERS-CoV, या SARS-CoV को 30 मिनट के लिए GC376 के साथ जोड़ा गया था और SARS-CoV पॉलीप्रोटीन पर दरार साइटों से प्राप्त किए गए edans / dabcyl FRET सब्सट्रेट मिश्रण में जोड़ा गया था। 30 मिनट के लिए ऊष्मायन के बाद, फ्
लोरेसेंस संकेतों को मापा गया और IC50 की गणना प्रत्येक 3CLpro [28-30] के लिए की गई।

3CLpro के तीन आयामी संरचनात्मक मॉडल

FIPV 3CLpro के संरचनात्मक मॉडल को TGEV 3CLpro (PDB ID: 4F49) [28] पर आधारित बनाया गया था जिसमें EasyModeller कार्यक्रम (संस्करण 4.0) [56] का उपयोग कर और MERS-CoV (PDB ID: 4WME, teal) की 3CLpro संरचना पर आधारित है। [40]। TGEV (PDB ID: 4F49) और MERS-CoV (PDB ID: 4WME) के सक्रिय स्थलों की सतह का प्रतिनिधित्व PyMol (DeLano वैज्ञानिक) [57] के साथ किया गया था।

सहायक जानकारी 

 

(ए) समय के साथ बिल्लियों का शारीरिक वजन। (बी-डी) समय के साथ विभिन्न रक्त रसायन मूल्यों या रक्त कोशिका की गिनती को साधनों और मानक त्रुटि के रूप में व्यक्त किया जाता है। एपी, क्षारीय फॉस्फेट। बून, रक्त यूरिया नाइट्रोजन। एएलटी, एलेनिन एमिनोट्रांस्फरेज़। एएसटी, एस्पार्टेट एमिनोट्रांस्फरेज़। एएलपी, क्षारीय फॉस्फेटस। एचजी, हीमोग्लोबिन।

(TIF)

एस 1 अंजीर। बिल्लियों में शरीर के वजन और रक्त कोशिका की गिनती और रक्त रसायन माप को उपचारात्मक रूप से सुरक्षा अध्ययन में GC376 के साथ प्रशासित किया गया है।

(ए) समय के साथ बिल्लियों का शारीरिक वजन। (बी-डी) समय के साथ विभिन्न रक्त रसायन मूल्यों या रक्त कोशिका की गिनती को साधनों और मानक त्रुटि के रूप में व्यक्त किया जाता है। एपी, क्षारीय फॉस्फेट। बून, रक्त यूरिया नाइट्रोजन। एएलटी, एलेनिन एमिनोट्रांस्फरेज़। एएसटी, एस्पार्टेट एमिनोट्रांस्फरेज़। एएलपी, क्षारीय फॉस्फेटस। एचजी, हीमोग्लोबिन।

(TIF) 

S2 अंजीर। FIPV 3CLpro के त्रि-आयामी संरचनात्मक मॉडल और TGEV और MERS-CoV के 3CLpro की सक्रिय साइट की सतह प्रतिनिधित्व।

(ए) MERS-CoV 3CLpro (PDB ID: 4WME, teal) का सुपरइम्पोजिशन [40] और FIPV 3CLpro (लाल) TGEV 3CLpro पर एक टेम्पलेट (PDB ID: 4F49) [28] के रूप में आधारित Modeller [56] का उपयोग कर बनाया गया है। TGEV और FIPV के 3CLpro को> 93% के एमिनो एसिड अनुक्रम पहचान के साथ अत्यधिक संरक्षित किया जाता है। कोरोनावायरस 3CLpro फ़ंक्शन के लिए मंद बनाता है लेकिन केवल मोनोमर फॉर्म यहां दिखाया गया है। टैन आयत में सक्रिय डोमेन I और II के बीच स्थित साइट है। MERS-CoV और FIPV, Cys और His के 3CLpro के सक्रिय साइट अवशेष क्रमशः नारंगी और नीले रंगों में दिखाए जाते हैं। अवशेषों (S131) ​​FIPV के 3CLpro में उत्परिवर्तित NPI52, NPI64 के एक एल्डिहाइड रूप के प्रतिरोधी है, बैंगनी में दिखाया गया है। (B और C) TGEV (PDB ID: 4F49) [28] (C) और MERS-CoV (PDB ID: 4WME) [40] (D) के 3CLpro के सक्रिय स्थलों का भूतल प्रतिनिधित्व। (बी) TCLV 3CLpro की क्रिस्टल संरचना, GCCL6 (ग्रे) के साथ SCL और GCL के सक्रिय साइट के S2 जेब में बंधी हुई थी, जिसे पहले हमारे समूह [२।] ने प्रकाशित किया था। S1 और S2 जेब में अवशेष जो GC376 के साथ हाइड्रोजन बांड बनाते हैं, पीले रंग में दिखाए गए हैं। (C) MERS-CoV 3CLpro का S1 और S2 पॉकेट गुलाबी रंग में दिखाया गया है। GC376 के साथ संभावित रूप से हाइड्रोजन बांड बनाने वाले अवशेषों का संकेत दिया जा सकता है। सभी चित्र PyMol का उपयोग करके नए तैयार किए गए थे।